Šiuolaikinė alerginių ligų laboratorinė diagnostika išsamiai

Greito tipo, IgE sukeltos alerginės ligos diagnozuojamos remiantis klinikiniais simptomais, ligos istorijos duomenimis ir alerginių tyrimų rezultatais. Alergenui specifiniai IgE yra nustatomi in vitro ir/ar  in vivo tyrimais. Kai kuriais atvejais įsijautrinimui patvirtinti atliekami provokaciniai mėginiai.

Specifiniams antikūnams (sIgE) nustatyti naudojami alergenų ekstraktai. Naudojant ekstraktus diagnostikai, galimi keli netikslumai. Dėl natūralios alergenų šaltinių įvairovės gali skirtis sudėtis, todėl alergenus, kaip substratus, sudėtinga standartizuoti. Kita problema, šiuo būdu neįmanoma atskirti pirminio įsijautrinimo nuo kryžminių reakcijų. Tai yra svarbu, ypač esant alergijai maistui. Siekiant išspręsti abi šias problemas, vyko intensyvūs tyrimai molekulinės alergologijos srityje. Per pastaruosius 30 metų tobulėjant molekulinei biologijai, atsirado galimybė išgryninti ir aprašyti pagrindinius alergenus, jų molekulinės struktūros lygmenyje. Gydytojams ir mokslininkams yra prieinami keli elektroniniai alergenų duomenų bankai (pvz., www.allergen.org arba www.allergome.org). Juose šiuo metu užregistruota daugiau nei 7200 alergenų. Kai kurie jų ateityje bus naudojami in vitro diagnostikoje kaip išgryninti natūralūs alergenai arba kaip rekombinantiniai baltymai.

Prieš naudojant molekulinius tyrimus diagnostikoje, svarbu žinoti jų klinikinę naudą. Alergenas gali būti bet kuri medžiaga, kurios sudėtyje yra baltymų. Dažniausiai alergeną sudaro daug skirtingų baltymų, kai kurie jų gali sukelti alerginių reakcijų. Kiekvienas alergenų komponentas yra sudarytas iš keleto skirtingų sudėtinių dalių (epitopų).  Epitopas yra trimatė specifinio antikūno prisijungimo vieta. Žinios apie baltymo struktūrą, priklausymą vienai ar kitai alergenų šeimai, atsparumą fiziniams (pvz., karščiui) ir fiziologiniams (pvz., virškinimui) veiksniams leidžia racionaliai naudoti alergenų komponentus alerginių ligų diagnostikai. Tokie baltymų atsparumo skirtumai gali paaiškinti, kodėl vieni maisto alergenai toleruojami valgant termiškai neapdorotus, o kitus būtina virti, termiškai apdoroti. Reakcijos į alergenus gali būti įvairios –  nuo lengvų (pvz., niežulio, dilgėlinio tipo bėrimo) iki vidutinių ir sunkių gyvybei pavojingų reakcijų (pvz., anafilaksinės reakcijos). Kai kuriais įsijautrinimo atvejais po kontakto su alergenu klinikinių simptomų gali ir nepasireikšti. Pagrindinės kryžmiškai reaguojančių baltymų šeimų savybės pateikiamos 1 lentelėje.

1 lentelė. Pagrindinės kryžmiškai reaguojančių baltymų šeimų savybės

Saugojimo / kaupimo baltymas

Alergenas esantis riešutuose ir sėklose (pvz., Ara h2) Atsparus karščiui ir virškinimui (reakcijos į termiškai apdorotą maistą) Susiję su sunkiomis, sisteminėmis alerginėmis reakcijomis kartu ar be BAS Retos kryžminės reakcijos tarp šios šeimos skirtingų alergenų rūšių

Nespecifiniai riebalų pernešimo baltymai  (angl. non-specific Lipid Transfer Pretein – nsLTP)

Alergenai, esantys vaisiuose, daržovėse, riešutuose ir žiedadulkėse (pvz., persiko – Pru p3) Atsparūs karščiui ir virškinimui Kaip maisto alergenas, dažnai susijęs su sunkiomis, sisteminėmis alerginėmis reakcijomis kartu ar be BAS Kryžminių reakcijų dažnis tarp šios alergenų šeimos rūšių yra įvairus

Tropomiozinas

Alergenas, esantis vėžiagyviuose (pvz., krevetės, krabai), namų dulkių erkėse, tarakonuose ir apvaliosiose kirmėlėse (nematoduose) Atsparus karščiui ir virškinimui Kaip maisto alergenas, dažnai susijęs su sunkiomis, sisteminėmis alerginėmis reakcijomis kartu ar be BAS Labai dažnos kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių

Lipokalinas

Alergenų komponentas, esantis plaukuotuose gyvūnuose (pvz., šuns – Can f1) Kryžminių reakcijų dažnis tarp šios alergenų šeimos rūšių yra įvairus

Parvalbuminai

Žuvyse ir varliagyviuose esantys alergenų komponentai (pvz., menkės – Gad c1) Atsparūs karščiui ir virškinimui Kaip maisto alergenai, dažnai susiję su sunkiomis, sisteminėmis alerginėmis reakcijomis kartu ar be BAS Labai dažnos kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių

Serumo albuminai

Gyvūnuose esantys alergenų komponentai (pvz., karvės piene, kraujyje, jautienoje ar epitelyje), (pvz., katės – Fel d2) Kaitinant ir virškinant ne visuomet suyra Įsijautrinus serumo albuminui, retai galimos reakcijos į  maistą (pvz., katės ir kiaulienos sindromas) Dažnos serologinės kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių, tačiau klinikinis reikšmingumas nežinomas

PR-10 baltymai, Bet v1 homologai

Alergenų komponentai, esantys žiedadulkėse, vaisiuose, daržovėse ir riešutuose (pvz., beržų – Bet v1) Daug PR-10 baltymų yra jautrūs karščiui ir virškinimui, termiškai apdorotas maistas dažniausiai toleruojamas gerai Dažnai susiję su vietiniais simptomais, burnos oraliniu sindromu Kryžminių reakcijų dažnis tarp šios alergenų šeimos rūšių yra įvairus

Polkalcinai (Kalcį sujungiantys baltymai)

Alergenų komponentai, esantys grūdinių kultūrų, medžių ir žolių žiedadulkėse (ne maisto produktuose) (pvz., beržų – Bet v4) Dažnos kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių

Profilinai

Alergenų komponentai, esantys augalinės kilmės maisto produktuose (pvz., grūdai, žolės, lateksas ir medžių žiedadulkės), (pvz., motiejukų – Phl p12) Neatsparūs karščiui ir virškinimui, termiškai apdorotas maistas dažniausia gerai toleruojamas Įsijautrinimas retai susijęs su klinikiniais simptomais, tačiau kai kuriems pacientams pasitaiko vietinių ar net sunkių reakcijų Dažnos kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių

Kryžmiškai reaguojanti karbohidratinė determinantė  (CCD)

Karbohidratinės grandinės yra žiedadulkėse, augalinės kilmės maiste, vabzdžiuose ir plėviasparnių nuoduose (pvz., MUXF3) CCD yra kryžminio įsijautrinimo žymuo Retos alerginės reakcijos, tačiau galimi klaidingai teigiami in-vitro tyrimo rezultatai tarp CCD turinčių alergenų Labai dažnos kryžminės reakcijos tarp šios alergenų šeimos rūšių

Šiuo metu siekiama kuo tiksliau diagnozuoti ligas. Alergologijoje svarbus pirminio (specifinio rūšiai) įsijautrinimo ir kryžminių reakcijų į panašią baltymo struktūrą atskyrimas. Tačiau alergenų komponentai yra svarbūs ir imunoterapinių ekstraktų standartizavimo procese, nes tai leidžia kontroliuoti alergenų specifinei imunoterapijoje naudojamų ekstraktų vienodą ir stabilią komponentinę sudėtį. Alergenų šaltinio, ekstrakto ir molekulinės sudėties pavyzdys pateiktas 1 pav.

1 pav. Alergenų šaltiniai, ekstraktai ir komponentinės sudėties schematinis pavyzdys

Alergenų komponentai gaunami dviem technologiniais būdais. Pirmuoju būdu rekombinantiniai komponentai, pasitelkus biotechnologijas, yra susintetinami laboratorijoje, kitas būdas – iš alergenų ekstraktų išgryninami natūralūs komponentai .  Yra nemažai alergenų ekstraktų, kurie išsamiai neaprašyti ir bus reikalingi neaiškių alerginių reakcijų ar neaiškiais įsijautrinimo įprastiems alergenams atvejais.

ALERGENŲ KOMPONENTAI IR ALERGINĖS REAKCIJOS SUNKUMAS

Alergijos maistui atvejais molekulinė diagnostika svarbi alerginių reakcijų rizikai įvertinti. Skirtingi maisto produktai yra sudaryti iš įvairių molekulių, kurios yra atsparios arba neatsparios karščiui ar virškinimui. Aiškus molekulės stabilumas ir ligos istorijos duomenys padeda gydytojui įvertinti vietinių ir sisteminių reakcijų riziką. Labilūs alergenai yra susiję su vietinėmis reakcijomis (pvz., burnos alergijos sindromas - BAS), termiškai apdorojus tokie maisto produktai dažniausia yra toleruojami. Tačiau įsijautrinimas stabiliems alergenų komponentams lemia sunkesnes ir net gyvybei grėsmingas alergines reakcijas. Molekuliniai alergijos tyrimai vertingi tiksliai diagnostikai, išvengiama nereikalingų dietų, reikia mažiau provokacinių mėginių.

BENDRIEJI DIAGNOSTIKOS PRINCIPAI

Diagnostika pradedama nuo paciento simptomų nustatymo ir fizinio ištyrimo. Taip sužinome paciento ligos trukmę, simptomų pasireiškimo laiką (simptomai pasireiškia nuolat ar būdingas  sezoniškumas), kitas su alergija susijusias gretutines ligas. Turint šią informaciją, sprendžiama, su kokiais alergenų ekstraktais tikslinga atlikti odos dūrio mėginius ar specifinių IgE tyrimus. Odos dūrio mėginiais netiesiogiai nustatomi antikūnai prieš specifinius alergenus. Gydytojas įvertina gautų tyrimų klinikinį reikšmingumą, pateikia  gydymo ar tikslesnio ištyrimo rekomendacijas (2 pav.).

2 pav. IgE sukeltų alerginių reakcijų ir ligų tyrimų planas

Kryžminėms reakcijoms atskirti nuo pirminio įsijautrinimo atliekami tikslesni (pvz., ImmunoCAP metodu)  specifinių alergenų komponentų molekuliniai tyrimai. Rezultatai užtikrins tikslų gydymo pasirinkimą arba paskatins atlikti provokacinius mėginius įsijautrinimo klinikiniam reikšmingumui patvirtinti (3 pav.).

3 pav. Tyrimų planas su tiksline molekuline diagnostika

Įvertinęs paciento klinikinius simptomus, atliktų tyrimų (odos dūrio, specifinių IgE, provokacinių mėginių) klinikinę reikšmę patvirtina gydytojas.

KLINIKINIAI ATVEJAI

Pirmasis atvejis. Pacientas skundžiasi esantis alergiškas obuoliams, lazdyno riešutams ir morkoms. Pavalgius šių produktų, jam tinsta burnos gleivinė, jaučia niežulį burnoje. Taip pat vargina čiaudulys, akių niežulys, ašarojimas, nosies užburkimas, varvėjimas pavasarį (simptomai kartojasi tris sezonus).

Simptomų interpretavimas ir diagnostika: atsižvelgiant į skundus ir ligos istorijos duomenis, įtariamas įsijautrinimas beržų alergenams ir kryžminės reakcijos su produktais, turinčiais panašų į Bet v 1 alergenų komponentą. Įsijautrinimui patvirtinti atliekami odos dūrio mėginiai, specifiniai IgE.

Antrasis atvejis. Pacientas skundžiasi burnos alergijos simptomais pavartojus vaisių ir daržovių, įskaitant melionus, citrusinius vaisius, bananus, avokadus ir žemės riešutus. Taip pat jį vargina birželio mėnesiais pasikartojantis rinitas ir čiaudulys.

Simptomų interpretavimas ir diagnostika: atsižvelgiant į skundus ir ligos istorijos duomenis, įtariamas įsijautrinimas motiejukams. Molekuliniame lygmenyje įtariamas įsijautrinimas profilinams, kuriems būdingos dažnos kryžminės reakcijos, šiuo atveju motiejuko Phl p 12 alergenų komponentui.

Trečiasis atvejis. Pacientas skundžiasi kelis kartus pasikartojusiu kraujospūdžio kritimu ir dilgėlinio tipo bėrimu visame kūne sportuojant. Abiem atvejais prieš sportą vartojo kviečių turinčių maisto produktų (bandelės, blynai).

Simptomų interpretavimas ir diagnostika: atsižvelgiant į skundus ir ligos istorijos duomenis, įtariama fizinio krūvio išprovokuota anafilaksinė reakcija po kviečių turinčių produktų vartojimo. Ši situacija galima dėl įsijautrinimo kviečių omega-5  Tri a 19 alergenų komponentui.

DIAGNOSTIKA ESANT POLISENSIBILIZACIJAI

Polisensibilizacija yra įsijautrinimas 3 ar daugiau alergenų. Sudėtingų klinikinių atvejų metu, kai nustatomas įsijautrinimas keletui alergenų arba yra sudėtinga paimti veninio kraujo vaikams, atliekamas alergenų mikrogardelės (angl. Immuno-Solid phase Allergen Chip – ISAC) tyrimas iš kapiliarinio kraujo. Šiuo tyrimu nustatomi antikūnai prieš 112 alergenų komponentų. Tokiu diagnostiniu metodu iš mažo kraujo serumo kiekio identifikuojamas pirminis įsijautrinimas, kryžmiškai reaguojantys komponentai ir dėl didelės tyrimo apimties aptinkami neįtarti, bet, spėjama, didelę reikšmę alerginėms reakcijoms išsivystyti turintys alergenai. ImmnoCAP ir ISAC technologijomis atliekamų tyrimų rezultatai sutampa, tačiau esant mažai specifinių IgE koncentracijai, ImmunoCAP tyrimas yra jautresnis dėl tyrimui naudojamo didesnio serumo kiekio. Pagrindiniai diagnostiniai ImmunoCAP, ISAC ir odos dūrio mėginių skirtumai pateigiami 2 lentelėje.

2 lentelė. Pagrindiniai ImmunoCAP, ISAC ir odos dūrio mėginių skirtumai

	Privalumai	Trūkumai
ISAC	30 µl serumo arba plazmos (arterinis arba veninis kraujas) 112 alergenų vieno tyrimo metu Neturi įtakos didelis bendrojo IgE kiekis	Neautomatizuotas Pusiau kiekybinis tyrimas Didesnis variacijos koeficientas Nėra kai kurių alergenų Mažiau tinkamas įsijautrinimo stebėsenai Galimas konkuravimas su IgE ir kitais izotipais,  daugiausia IgG
ImmunoCAP	Automatizuotas metodas Kiekybinis tyrimas Didelis jautrumas Mažas variacijos koeficientas Naudojami natūralūs, rekombinantiniai baltymai ir alergenų ekstraktai Tinkamas įsijautrinimo stebėsenai	40 µl serumo vienam alergenui ištirti Kiekvienas alergenas nustatomas atskiru tyrimu Aptinka mažus antikūnų kiekius, kurie yra kliniškai nereikšmingi
Odos dūrio mėginiai	Didelis jautrumas Greiti rezultatai	Neautomatizuotas Vienas alergenas vienu dūriu Naudojami tik alergenų ekstraktai Netinka įsijautrinimo stebėsenai

Pagal tarptautines rekomendacijas, ISAC tyrimui tinkamiausi pacientai yra vaikai, įsijautrinę daugeliui alergenų, ir suaugusieji, kuriems nustatytas įsijautrinimas kryžmiškai reaguojantiems alergenams.  Tyrimų gairės, kai diagnozuota polisensibilizacija, pateikiamos 4 pav.

4 pav. Polisensibilizacijos tyrimo algoritmas

ALERGIJA KIAUŠINIUI. MOLEKULINĖS DIAGNOSTIKOS REIKŠMĖ.

Kiaušinio baltymas yra pagrindinis alergenų šaltinis kiaušinyje. Išskiriami 5 pagrindiniai kiaušinio alergenų komponentai (Gal d 1 -5). Kiekvienas jų pasižymi skirtingomis alergeninėmis savybėmis. Didelė specifinių IgE antikūnų prieš Gal d 1 koncentracija rodo didelę alerginės reakcijos riziką pavartojus tiek žalio, tiek termiškai apdoroto kiaušinio. Jei Gal d 1 antikūnų titras mažas ar jų neaptinkama – toleruojamas stipriai termiškai apdorotas kiaušinis, pavyzdžiui, sausainiuose. Esant sensibilizacijai ovalbuminui (Gal d 2), galima reakcija į gripo bei geltonosios karštinės vakcinas, nes jos gaminamos iš viščiuko embriono ir vakcinoje gali likti šio baltymo pėdsakų. Lizocimas (Gal d 4) naudojamas kaip konservantas (žymimas E 1105) kai kuriuose farmacijos produktuose, taip pat brandintame sūryje, vyne. Kai kraujyje aptinkama specifinių IgE antikūnų prieš Gal d 2, Gal d 3 bei Gal d 4, pacientui alerginė reakcija išsivysto suvartojus žalio ar mažai termiškai apdoroto kiaušinio. Serumo albumino (Gal d 5) yra kiaušinio trynyje, įsijautrinus jam, galimos kryžminės reakcijos su paukštiena ir įkvepiamais paukščių alergenais.

Įtarus alergiją kiaušiniui ir atliktus priminius alergologinius tyrimus (odos dūrio mėginius, specifinius IgE), diagnozei patvirtinti galima pagalvoti apie rekomendacijas pacientui. Gavus molekulinio tyrimo atsakymus, galima tiksliau įvertinti alerginės reakcijos riziką ir kartais išvengti nereikalingo maisto produktų vengimo. Taigi molekuliniai alerginiai tyrimai turi akivaizdžios naudos ne tik skiriant tinkamiausią gydymą, bet ir užtikrinant paciento komfortą.

APIBENDRINIMAS

Pagal tarptautines rekomendacijas, alerginių ligų diagnostika pirmiausia pradedama odos dūrio mėginiais (pirmas pasirinkimas) arba specifinių IgE nustatymu (antras pasirinkimas). Molekulinė alerginių ligų diagnostika (trečias pasirinkimas) pasirenkama pacientams, kuriems pirmame arba antrame etape nepavyko tiksliai nustatyti teigiamų alergologinių tyrimų klinikinės reikšmės. Gydytojams specialistams molekulinė diagnostika galima kaip antras tyrimo etapas. Molekulinė diagnostika padeda atskirti pirminį įsijautrinimą nuo kryžminių reakcijų, nuspėti galimų alerginių reakcijų sunkumą, išvengti nereikalingo maisto produktų ribojimo, tiksliau parinkti patogenezinį gydymą specifine alergenų imunoterapija. Kitaip tariant, molekulinis alergenų tyrimas gali padėti efektyviai sutaupyti tiek gydytojų, tiek pacientų laiką ieškant ne tik alergijos sukėlėjų, bet ir veiksmingų jos gydymo priemonių.

Molekuliniai alergijos tyrimai Vilniuje, Kaune ir kituose miestuose

Šie alergijos tyrimai vaikams ir suaugusiems gera kaina atliekami Allergomedica klinikoje, tačiau norėdami užtikrinti, kad jie būtų pasiekiami kiekvienam, susidūrusiam su alerginėmis reakcijomis, siūlome kraujo mėginį priduoti ir kituose miestuose. Kontaktų sąraše rasite adresus, kur ai galite padaryti – išsirinkite sau artimiausią ir po to, kai kraujo tyrimas alergijai nustatyti bus atliktas, elektroniniu paštu sulauksite išsamaus ir aiškaus atsakymo.

Straipsnio autoriai:
Gyd. Kotryna Linauskienė, doc. Laura Malinauskienė
Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Infekcinių ligų,
dermatovenerologijos ir alergologijos klinikos
Pulmonologijos ir alergologijos centras

Naudota literatūra

1. Borres MP, Ebisawa M, Eigenmann PA. Use of allergen components begins a new era in pediatric allergology. Padiatr Allergy Immunol 2011; 22:454-61.
2. Sastre J. Molecular diagnosis in allergy. Clin Exp Allergy 2010; 40:1442-60.
3. Prescott S, Allen KJ, Food allergy: riding the second wave of the allergy epidemic. Pediatr Allergy Immunol 2011; 22: 155-60.
4. Kleine-Tebbe J, Jakob T. Molecular allergy diagnostics in clinical practice. Part A molecular allergology: general concepts. Mollecular allergology User‘s guide. The European Academy of Allergy and Clinical Immunology. John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd. Vienna, Austria 2016
5. Crameri R. The crux with a reliable in vitro and in vivo diagnosis of allergy. Allergy 2013; 68:393-4.
6. Valenta R, Niederberger V. Recombinant allergens for immunotherapy. Clin Immunol 2007; 119: 826-30.
7. Lucas JM. Microrrays: molecular allergology and nanotechnology for personalised medicine (I). Allergol Immunopathol 2010; 38:153-61.
8. Canonica GW, Ansotegui IJ, Pawankar R ir kt. A WAO-ARIA-GA²LEN consensus document on molecular-based allergy diagnostics. World Allergy Organization Journal. 2013; 6:17.
9. Agache I, Bilo M, Braunstahl GJ, Delgado L ir kt. In vivo diagnosis of allergic diseases – allergen provocation tests. Allergy 2014; 69:1008-25.
10. Chapman MD, Wuenschann S, King E Pomes A. Innovations for High-Throughput Approaches to In Vitro Allergy Diagnosis. Curr Allergy Asthma Rep 2015; 15:36.
11. Werfel T, Asero R, Ballmer-Weber BK, Beyer K ir kt. Position paper of the EAACI: food allergy due to immunological cross-reactions with common inhalant allergens. Allergy 2015; 70:1079-90.